Purificación parcial de interferón humano tipo alfa para su uttilización en productos farmacéuticos / Partial purification of Hu-IFN-* for pharmaceutical purposes

La purificación parcial del Hu-IFN-* se logra en un solo paso por adsorción y elución sobre ácido silícico. La recuperación de la actividad antiviral es del 80-100 por ciento, con un aumento de la actividad específica de aproximadamente 20-80 veces. El producto obtenido por este método es estable y apropiado para ser utilizado en terapéuticas locales

Estudios sobre la producción de un Interferón recombinante alfa humano expresado bajo el control del promotor lac UV5 de Escherichia coli / Research on production of recombinant alpha human interferon expressed by control of lac UV5 promotor of Escherichia coli

La inserción de un oligonucleótido de 18 pares de bases en el sitio Pvull, ubicado en la región que codifica para el prepéptido del gen de IFN * 2 humano, resultó en un notable incremento en la actividad antiviral producida en E. coli bajo el control de los promotores lac UV5 situado en un plásmido recombinante. El máximo de actividad antiviral específica, cuando se utilizó E. coli HB 101 como célula hospedadora, se produjo en la mitad de la fase exponencial, después de lo cual se observó una marcada caída. Cuando se utilizó E. coli JM 101, que solo permite la síntesis del antiviral en presencia del inductor (IPTG), el máximo se observó una hora y media después de agregado este inductor, cualquiera fuere el punto de la curva de crecimiento. El contenido plasmídico por célula durante el ciclo de crecimiento se mantuvo constante. Cuando se amplificó el número de copias del plásmido por pretratamiento de las bacterias con cloranfenicol, se amplificó la capacidad de síntesis en los puntos iniciales de la curva de crecimiento. La vida media del antiviral en extractos bacterianos crudos fue de 75 minutos a 37-C y 165 minutos a 30-C. La disminución de la temperatura de cultivo de 37-C a 34-C durante la producción, aumentó la velocidad inicial de acumulación del producto, pero el máximo alcanzado en la actividad específica del antiviral no varió

Producción de un polipéptido con actividad antiviral por fusión del gen interferón-alpha 2 humano al gen lacZ del bacteriófago M13mp8 / Production of a polypeptide with antiviral activity by fusion of the alpha 2 IFN gen to the lacZ gen in the M13mp8 bacteriophage

Un gen de IFN-* recientemente aislado en nuestro laboratorio a partir de una librería de ADN crosomal humano, fue genéticamente manipulado in vitro para poder acortar la secuencia señal y mejorar el rendimiento de IFN en cultivos bacterianos. Primero, la secuencia señal fue acortada en una extensión equivalente a nueve codones, usando la enzima de restricción HacIII y la secuencia remanente fue fusionada en fase con el codón iniciador del gen lacZ presente en el bacteriófago M13mp8. Uno de los clones recombinantes fue analizado en detalle. Este clon mostró una alta inestabilidad del inserto y una baja producción de actividad IFN, con un rendimiento similar al obtenido con el gen pre-IFN-*2 completo. El gen fusionado lacZ/IFN-* fue entonces transferido por clonaje mplecular al plásmido pBR322. Uno de los clones obtenidos mostró una buena estabilidad del plásmido híbrido, y aunque el rendimiento de actividad de IFN fue bajo (3x 10 a la 5 unidades/ml de extracto bacteriano crudo) la producción se mantuvo aún después de más de 20 pases. Finalmente, la secuencia señal recombinante presente en este clon fue nuevamente acortada en una extensión equivalente a 4 codones y se encontró que uno de los nuevos clones incrementaba aproximadamente en 20 veces el nivel de producción de actividad IFN. A pesar de que el polipéptido sintetizado constituye un producto de fusión, la actividad biológica antiviral de IFN parece quedar conservada